获1993年度卫生厅表扬奖

获得者：李学忠  金淑仙  杨品芳  余文祥

云南省疟疾防治研究所

 

提要：本文对采自我省不同疟区162份干血滴，包括恶性疟51例与间日疟111例，采用由当地分离的恶性疟原虫可溶性抗原进行ELISA 试验，并用食蟹猴疟原虫（P.cynomolgi）替代抗原作对比，结果显示使用两种抗原的阳性符合率基本一致，但是用P.f抗原的几何平均滴度显著高于用P.c抗原者（371.76，324.68；P<0.05），用P.f抗原测恶性疟患者血清阳性几何平均滴度显著高于用P.c抗原（527.8，383.71；t=1.72P<0.05）。在单纯间日疟区采集的49份血样使用P.c抗原的抗体阳性几何平均滴度显著高于P.f抗原，前者为388.84，后者为250.79（t=2.91 P<0.01.）

 

为提高微量酶联免疫吸附试验的灵敏度及应用于现场调查的准确性，本文用体外培养的恶性疟原虫制备抗原进行试验，并同时用食蟹猴疟原虫抗原作比较。

 

材料和方法

一、抗原制备：

1、同种抗原：所用恶性疟原虫系由思茅县一男性青年患者血中分离获得，  用Trager等的烛缸法培养传代。

2、替代抗原：食蟹猴疟原虫自感染黄猴体内获得。当寄生率均达10%左右并以裂殖体和大滋养体期为主时收集，经2,000rpm离心20分钟，弃上清后再用PBS pH7.4洗涤2次，压积细胞用过量重蒸水充分溶解2次，即得呈棕褐色的疟原虫，加入0.01M PBS pH7.45ml，混匀后于冰浴中用本溪产250W超声细胞粉碎器处理5次（每次1分钟，间隔1分钟），取出后经10000rpm4℃冷冻离心30分钟，上清即为可溶性抗原，用紫外光吸收法测定蛋白含量恶性疟原虫抗原为1.26mg/ml，食蟹猴原虫抗原为3.09mg/ml，测试最适稀释度后即包被平板待用。

二、结合物制备：根据骆加里的戊二醛过碘酸钠简易标记法进行标记。羊抗人IgG为本所自制，辣根过氧化物酶系上海东风试剂厂产品，RZ=3，标记后加等量甘油混匀保存，测试结合物最适稀释度，以消光值为1. 0 时的滴度作为最适稀释度，结果为1:4000（纯浓度为1:8000）。

三、血样来源：162份阳性干血滴分别采自恶性疟兼有间日疟流行的疟区( 下称混合疟区)113份，以及单纯间日疟流行的疟区49份。健康人干血滴采自己控制流行20 余年的思茅城区托儿所及小学共87份，每例试验对象均经原虫血片镜检，并由耳垂前取血蘸在滤纸上使自然扩展至径为1.2cm，晾干后放入有干燥剂的塑料袋，冷藏带回实验室4℃保存。

四、试验方法：按1978年WHO酶标学习班讲义进行，采用上海塑料三厂生产的40孔聚苯乙烯反应板作载体，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，底物使用邻苯二胺（OPD）过氧化氢（H₂O₂）系统，每份血样同时用两种抗原平行测试，结果判读用MR590型Micro ELISA Minireader，选用490nm波长。[NextPage]

 

结    果

一、两种可溶性抗原最适稀释度的测量：用pH9.6碳酸缓冲液分别将两种抗原作1:50～1:12,800倍比稀释后顺序包被平板，按常规操作用2份恶性疟与1份间日疟阳性血滴作1:100稀释平行测定PBS为对照，选择消光值1.0时的稀释度为最适稀释度，结果两种抗原均为1:1000。

二、两种抗原阳性阈值的确定：按常规测试，所采集的162份阳性干血滴及87份健康人干血滴，以第一个稀释度（1:100）的消光值为准，选择上述两种血样消光值差异最显著点作为阈值。试验结果，阳性值定为消光值0.4以上（含0.4）。

三、用两种抗原同法平行测试162份阳性干血滴的抗体阳性率，P.f抗原为99.38%，（161/162），P.c抗原为97.53%（158/162），两者无显著差异（P>0.05），但P.f 抗原的阳性几何平均滴度显著高于P.c抗原，分别为371.76和314.25（P<0.05）。另外用P.f 和P.c抗原检测87例健康血样，假阳性率为1.14%和8.04%，前者低于后者。

四、两种抗原的特异性：为进一步了解两种抗原的特异性，将51例恶性疟以及在111例间日疟中采自混合疟区的62例，采自单纯间日疟流行区的49例分别用两种抗原测试，结果抗体阳性率基本一致，但p.f抗原对同种血样的阳性GMRT显著高于p.c 抗原（527.8，383.7T；t=1.72，P＜0.05）。而p.c抗原检测单纯间日疟区49份血滴的阳性几何平均滴度高于p.f抗原（288.84，250.79；t=2.91，P＜0.01）；而有p.f 抗原检测混合疟区62份间日疟血滴抗体阳性几何平均滴度显著高于用P.c抗原（386.8，220.06；t=4.49，P＜0.01），可能与这些患者中有些以往患过恶性疟残存有p.f抗体有关。

 

讨    论

应用ELISA检测疟疾抗体，国内外已有不少报道，Spencer等应用体外培养p.f 制备的抗原在萨尔瓦多试验表明ELISA是疟疾流行病学调查研究的一种灵敏方法；Quakyi等证明p.f抗原对同种阳性血清滴度高于异种；王捷等应用p.f抗原检测3.7份确诊疟疾病人的疟疾抗体，两者阳性符合率为90.2%，其中恶性疟阳性符合率为94.3%， 间日疟符合率为84.9%。表明对恶性疟的阳性符合率明显高于间日疟。目前对p.f抗原与p.c抗原进行ELISA的比较尚不多见。为比较两种抗原的使用价值，本研究应用从思茅县分离的一株恶性疟原虫培养，仅用寄生率约10%、压积细胞约3ml 的虫血制备的可溶性抗原，其效价即与用35ml寄生率为10%的P. cynomolgi虫血制备的抗原基本相同，均为1:1000左右，制备本株p.f抗原、蛋白含量较低且未经同步性处理，说明本株p.f抗原活力较高。

本试验使用p.f抗原进行ELISA对87份健康儿童血样的测试，符合率达98.9%，而P.c抗原对这87份健康人血样进行平行测试，符合率只有92.0%，假阳性率为8.1%(7例)。 对162例确诊患者干血滴的试验，结果用P.f抗原的阳性符合率为99.4%(161/162)，其中一例假阴性患者是出生三个月的婴儿，于发病当天采血，出现假阴性反应，可能是免疫系统尚未发育完全，对病原体的刺激不不能产生应答以及发作时间短、IgG抗体尚未产生到足以被这种方法查见的水平。如果排除这一例，则p.f抗原对该批确诊阳性患者的血滴，抗体阳性符合率为100%，而用p.c抗原的符合率仅为96.9%，两种抗原的阳性符合率有显著差异；P＜0.025。进一步证实P.f抗原对检出混合病区病人血清抗体的灵敏度较高。

应用血清学的方法进行疟疾流行病学研究，抗体滴度的变化是一项重要指标,作为动态的研究，抗体滴度水平的变化比抗体阳性率更为灵敏。本次试验用p.f抗原检测p.f患者血滴，抗体阳性GMRT显著高于P.c抗原，证明P.f抗原对同种疟疾有较高的特异性。反之，p.c抗原对间日疟患者血样有较高的交叉免疫反应,显示P.c抗原与P.v 抗原可能有较多的共同成份。据此，我们初步认为，在混合疟区使用p.f抗原优于p.c抗原，而单纯间日疟区应用p.c抗原亦有较高的敏感性。

 

 

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